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细胞色素C技术工作方法分享说明
点击次数:78 发布时间:2018-10-27
   细胞色素C是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白,只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间,是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶,并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
 
  细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,分子量约为13000,肽链中含有19个赖氨酸残基,为一碱性蛋白, 等电点(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠,它是一种阳离子交换剂,细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷,它可与沸石分子上的钠离子发生交换,从而被沸石吸附。装入层析柱后,用25%硫酸铵洗脱,又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度,主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合,必须严格控制三氯乙酸用量。
 
  细胞色素C与材料试剂
 
  1、 设备:组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
 
  2、 仪器:剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
 
  3、 试剂:联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵。
 
  4、 材料:新鲜猪心(2个)。
 
  细胞色素C实验步骤
 
  1、预处理:健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中(保护酶的活性,避免捣碎机破碎时使酶失活)—→放入生理盐水中清洗去污—→称重:烧杯80g ,烧杯+猪心=240g,(240-80)×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min (匀浆3min ,停5min ,为了保证捣碎机安全)
 
  2、提取:搅拌后静置2h —→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中,在过滤后静置2h —→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH 至6.0,静置30min ,过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH 至7.5,静置30min, 过滤
 
  3、吸附:加10%人造沸石(滤液为220ml )—→磁力搅拌器搅拌吸附1h —→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用
 
  4、洗脱:在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱,流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液(没分辨出红色液体阶段,收集了所有洗脱液)
 
  5、盐析:在洗脱液(300ml )中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌,使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤,收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液(过滤液和20%三氯乙酸溶液zui好在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性)—→加完后分成8管,立即离心—→无明显沉淀,再5000转离心15min —→无明显沉淀,向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min —→无明显沉淀,实验结束
 
  6、透析 将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml 烧杯中(用磁力搅拌器搅拌),用去离子水透析, 除去硫酸根离子,15min 换水一次,换手3~4次后,检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法:取2ml 氯化钡溶液加入试管中,滴加2~3滴透析外液至试管中,若出现白色沉淀,表示硫酸根离子未除尽,如果不出现沉淀,表示透析完全。将透析液过滤, 收集滤液即为细胞色素C 粗品。 记录此粗品的体积。
 
  实验目的:
 
  1、通过细胞色素C的制备,了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤
 
  2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法
 
  实验原理:
 
  细胞色素是一类含有铁啉基团的电子传递蛋白,只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色素C是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B和细胞色素氧化酶之间,是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶,并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。
 
  结果表明,细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间;不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高,等电点为10.7,含铁量为0.38%~0.43%,Mr为12000~13000,猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。
 
  细胞色素C分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定,不易变性。pH 7.2~10.2,100℃加热3分钟,细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%,若增加加热时间,氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定,可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的,因为比较稳定并易于保存。
 
  细胞色素C 是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶,广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量zui为丰富。细胞色素C 位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中,分子量约为13000,肽链中含有19个赖氨酸残基,为一碱性蛋白, 等电点(10.5~10.8)高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠,它是一种阳离子交换剂,细胞色素C 分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷,它可与沸石分子上的钠离子发生交换,从而被沸石吸附。装入层析柱后,用25%硫酸铵洗脱,又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度,主要为去除杂蛋白。另外乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合,必须严格控制酸用量。
 
  细胞色素C与材料试剂
 
  1、 设备:组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱。
 
  2、 仪器:剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管。
 
  3、 试剂:联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、、人造沸石、氢氧化铵。
 
  4、 材料:新鲜猪心(2个)。
 
  结果表明,细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间;不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高,等电点为10.7,含铁量为0.38%~0.43%,Mr为12000~13000,猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白,它易溶于水及酸性溶液,故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种,氧化型水溶液呈深红色,还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定,不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟,细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%,若增加加热时间,氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定,可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的,因为比较稳定并易于保存。
 
  细胞色素C不是根据辅基来命名;与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是,细胞色素c通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。细胞色素e尚无,但有细胞色素f(细胞色素c中的一种)。[3]此外,细胞色素d仅存在于细菌中。

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